Inhoud
Gelelektroforese is een techniek waarmee DNA kan worden geanalyseerd op het niveau van de samenstellende moleculen. Bij deze DNA-visualisatiemethode worden monsters op een agarosegelmedium geplaatst en wordt een elektrisch veld op de gel aangebracht. Dit zorgt ervoor dat fragmenten van DNA met verschillende snelheden door de gel migreren in overeenstemming met hun elektrochemische eigenschappen.
Ethidiumbromide
Voor deze visualisatietechniek wordt ethidiumbromide gemengd met agarosepoeder, EDTA-buffer en water om de gelmatrix te vormen vóór elektroforese. Als een resultaat worden de ethidiumbromide-moleculen uniform door de matrix gedispergeerd. Zodra de gelsputten zijn gevuld met hun respectieve DNA-monsters en volgkleurstoffen, wordt spanning aangelegd om de grote, polaire verbindingen langzaam over de matrix te trekken.
Tijdens deze beweging binden de basen van de DNA-moleculen zich tijdelijk aan de deeltjes dankzij de ethidiumbromidelading en slepen ze mee. Tegen de tijd dat de gelelektroforese voltooid is, heeft elk DNA-molecuul een significante hoeveelheid ethidiumbromide opgepikt.
In aanwezigheid van ultraviolet licht vertoont ethidiumbromide fluorescentie. Technici schijnen een speciaal gekalibreerd UV-licht over de gel terwijl een machine het beeld van de gloeiende fragmenten vastlegt.
Methyleenblauw
Als een UV-transilluminator niet beschikbaar of praktisch is, kunnen technici DNA onder normale omstandigheden zichtbaar maken door de gerede agarosegel, met binnen geëlektroforeerd DNA, een nacht in een oplossing van methyleenblauw te weken.
Een chloridezout met een aanzienlijk hydrofoob anion, methyleenblauwe moleculen dringen de gehele gelmatrix binnen. De waterstofbinding doorheen DNA veroorzaakt echter dat de vlekmoleculen zich ophopen. Deze verhoogde dichtheid van DNA-vlekken levert een diepere blauwtint op, zichtbaar voor het blote oog.
Tracking kleurstoffen
Naast de relatieve grootte van de DNA-banden, kunnen technici de absolute grootte (in basenparen) van elk fragment meten met behulp van chemicaliën die tracking-kleurstoffen worden genoemd. Zichtbaar zonder toevoeging van methyleenblauw of ethidiumbromide, volgen volgkleurstoffen zoals bromofenolblauw en xyleencyanol over de aragosegelmatrices tijdens elektroforese met dezelfde snelheid als DNA-fragmenten bestaande uit respectievelijk 300 nucleotiden en 4000 nucleotiden. Bij elektroforese reizen massievere DNA-fragmenten langzamer over de gelmatrix dan kleinere fragmenten. Hoewel tracking-kleurstoffen niet direct de zichtbaarheid van DNA-fragmenten beïnvloeden, stellen technici het vergelijken van de positie van een DNA-fragment in de gel met de positie van deze kleurstoffen in staat het geschatte aantal nucleotiden dat het DNA-fragment bevat te "zien".