Inhoud
- DNA-klonen: definitie en procesoverzicht
- De Plasmid Vector-methode
- De PCR (Polymerase Chain Reaction) -methode
- Samen de Plasmidevector en PCR-DNA-kloneringsmethoden gebruiken
- Voorbeelden van DNA-klonen voor biotechnologie
- Voorbeelden van DNA-klonen voor onderzoek
- Voorbeelden van DNA-klonering voor gentherapie
Het is mogelijk om hele organismen zoals Dolly de schapen te klonen, maar DNA-klonen is anders. Het maakt gebruik van moleculaire biologietechnieken identieke kopieën van DNA-sequenties of enkele genen.
Met behulp van genetische manipulatiemethoden worden segmenten van de genetische DNA-code geïdentificeerd en geïsoleerd. Klonen van DNA kopieert vervolgens de nucleïnezuursequenties in de segmenten.
De resulterende identieke kopieën kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek of voor biotechnologische toepassingen. Vaak codeert het gen dat wordt gekopieerd voor een eiwit dat deel kan uitmaken van medische behandelingen. DNA-technologie inclusief DNA klonen ondersteunt het begrip van hoe genen werken en hoe de genetische code van mensen het functioneren van het lichaam beïnvloedt.
DNA-klonen: definitie en procesoverzicht
DNA-klonen is het moleculaire biologieproces waarbij identieke kopieën worden gemaakt van DNA-segmenten in de chromosomen die de genetische code van geavanceerde organismen bevatten.
Het proces genereert grote hoeveelheden van de doel-DNA-sequenties. Het doel van DNA-klonering is om de doel-DNA-sequenties zelf te produceren of om de eiwitten te produceren die in de doelsequenties worden gecodeerd.
De twee methoden die worden gebruikt bij het klonen van DNA worden genoemd plasmidevector en polymerase kettingreactie (PCR). In de plasmidevector methode worden DNA-strengen gesneden met behulp van restrictie-enzymen om DNA-fragmenten te produceren, en de resulterende segmenten worden ingevoegd in kloneringsvectoren plasmiden genoemd voor verdere duplicatie. De plasmiden worden in bacteriecellen geplaatst die vervolgens de DNA-kopieën of gecodeerde eiwitten produceren.
In de PCR-methodewordt het te dupliceren segment van DNA-strengen gemarkeerd met enzymen primers. Een polymerase-enzym maakt kopieën van het gemarkeerde deel van de DNA-streng. Deze methode gebruikt geen restrictie-enzymen en kan gekloond DNA produceren uit kleine monsters. Soms worden de twee DNA-technologiemethoden samen gebruikt om de beste eigenschappen van elk in een algemene reactie op te nemen.
De Plasmid Vector-methode
De vector van de methode verwijst naar het plasmide dat wordt gebruikt om het te klonen doel-DNA-segment te bevatten. Plasmiden zijn kleine cirkelvormige strengen van niet-chromosomaal DNA gevonden in veel organismen, waaronder bacteriën en virussen.
Bacteriële plasmiden zijn de vector die wordt gebruikt voor het invoegen van het doel-DNA-segment in bacteriële cellen voor verdere duplicatie.
Het doel-DNA selecteren en isoleren: Voordat het DNA-kloneringsproces kan beginnen, moeten de DNA-sequenties worden geïdentificeerd, vooral het begin en het einde van de DNA-segmenten.
Dergelijke DNA-sequenties kunnen worden gevonden door bestaand gekloneerd DNA met bekende sequenties te gebruiken of door het eiwit te bestuderen dat door de doel-DNA-sequentie wordt geproduceerd. Zodra de sequentie bekend is, kunnen de overeenkomstige restrictie-enzymen worden gebruikt.
Het doel-DNA knippen met restrictie-enzymen: Restrictie-enzymen worden geselecteerd om te zoeken naar de DNA-code aan het begin en einde van de doelsequenties.
Wanneer de restrictie-enzymen een speciale gecodeerde sequentie van basenparen vinden die restrictieplaatsen worden genoemd, hechten ze zich aan het DNA op die locatie en winden zich rond het DNA-molecuul, waardoor de streng wordt gescheiden. De gesneden DNA-segmenten die de doelsequentie bevatten, zijn nu beschikbaar voor duplicatie.
De plasmidevector kiezen en het doel-DNA invoegen: Een geschikt plasmide bevat idealiter dezelfde DNA-coderende sequenties als de DNA-streng waaruit het doel-DNA werd gesneden. De cirkelvormige DNA-streng van het plasmide wordt gesneden met dezelfde restrictie-enzymen die werden gebruikt voor het knippen van het doel-DNA.
EEN DNA-ligase-enzym wordt gebruikt om DNA-segmentkoppeling te bevorderen, en de uiteinden van het doel-DNA-segment koppelen aan de afgesneden uiteinden van het plasmide-DNA. Het doel-DNA maakt nu deel uit van de cirkelvormige plasmide-DNA-streng.
Het plasmide invoegen in een bacteriële cel: Zodra het plasmide de DNA-sequentie bevat die moet worden gekloond, kan het feitelijke kloneren plaatsvinden met behulp van een proces dat wordt genoemd bacteriële transformatie. De plasmiden worden ingebracht in een bacteriecel zoals E. coli, en de cellen met de nieuwe DNA-segmenten zullen kopieën en de overeenkomstige eiwitten gaan produceren.
Bij bacteriële transformatie worden de gastheercellen en plasmiden ongeveer 12 uur samen bij lichaamstemperatuur geïncubeerd. De cellen absorberen enkele van de plasmiden en behandelen ze als hun eigen plasmide-DNA.
Het oogsten van het gekloneerde DNA en eiwitten: De meeste plasmiden die worden gebruikt voor DNA-klonering hebben antibioticaresistentie genen opgenomen in hun DNA. Naarmate de bacteriecellen de nieuwe plasmiden absorberen, worden ze resistent tegen antibiotica.
Wanneer de kweek met antibiotica wordt behandeld, overleven alleen die cellen die de nieuwe plasmiden hebben geabsorbeerd. Het resultaat is een pure cultuur van bacteriecellen met gekloneerd DNA. Dat DNA kan vervolgens worden geoogst of het overeenkomstige eiwit kan worden geproduceerd.
De PCR (Polymerase Chain Reaction) -methode
De PCR-methode is eenvoudiger en kopieert het bestaande DNA op zijn plaats. Het vereist geen knippen met restrictie-enzymen of het invoegen van plasmide-DNA-sequenties. Dit maakt het vooral geschikt voor het klonen van DNA-monsters met een beperkt aantal DNA-strengen. Hoewel de methode DNA kan klonen, kan deze niet worden gebruikt voor de productie van het overeenkomstige eiwit.
De DNA-strengen afwikkelen: DNA in chromosomen is strak opgerold in een dubbele helixstructuur. Verwarmen van het DNA tot 96 graden Celsius in een proces genaamd denaturatie laat het DNA-molecuul afwikkelen en scheiden in twee strengen. Deze scheiding is vereist omdat slechts één DNA-streng tegelijkertijd kan worden gekloond.
De primers selecteren: Net als bij het klonen van plasmide-vector-DNA moeten de te klonen DNA-sequenties worden geïdentificeerd met speciale nadruk op het begin en einde van de DNA-segmenten. Primers zijn enzymen die zich hechten aan specifieke DNA-codesequenties en deze moeten worden geselecteerd om de doel-DNA-segmenten te markeren. De juiste primers zullen zich hechten aan de DNA-molecuulsequenties om het begin en einde van de doelsegmenten te markeren.
Ontharden van de reactie om de primers te binden: Het afkoelen van de reactie tot ongeveer 55 graden Celsius wordt genoemd gloeien. Terwijl de reactie afkoelt, worden de primers geactiveerd en hechten ze zich aan de DNA-streng aan elk uiteinde van een doel-DNA-segment. De primers werken alleen als markers en de DNA-streng hoeft niet te worden gesneden.
Het produceren van identieke kopieën van het doel-DNA-segment: In een proces genaamd uitbreidinghet warmtegevoelige TAQ-polymerase-enzym wordt aan de reactie toegevoegd. De reactie wordt vervolgens verwarmd tot 72 graden Celsius, waardoor het enzym wordt geactiveerd. Het actieve DNA-polymerase-enzym bindt aan de primers en kopieert de DNA-sequentie daartussen. Het initiële DNA-sequencing- en kloneringsproces is voltooid.
De opbrengst van gekloond DNA verhogen: Het initiële uitgloeiings- en extensieproces maakt relatief weinig kopieën van de beschikbare DNA-strengsegmenten. Om de opbrengst te verhogen door extra DNA-replicatie, wordt de reactie opnieuw afgekoeld om de primers opnieuw te activeren en te laten binden aan andere DNA-strengen.
Vervolgens activeert het opnieuw verwarmen van de reactie het polymerase-enzym opnieuw en worden meer kopieën geproduceerd. Deze cyclus kan 25 tot 30 keer worden herhaald.
Samen de Plasmidevector en PCR-DNA-kloneringsmethoden gebruiken
De plasmidevectormethode steunt op een ruime initiële toevoer van DNA om in plasmiden te knippen en in te voegen. Te weinig origineel DNA resulteert in minder plasmiden en een langzame start van gekloneerde DNA-productie.
De PCR-methode kan een grote hoeveelheid DNA produceren uit enkele originele DNA-strengen, maar omdat het DNA niet in een bacteriële cel wordt geïmplanteerd, is eiwitproductie niet mogelijk.
Om het eiwit te produceren dat wordt gecodeerd in de DNA-fragmenten die moeten worden gekloond uit een klein initieel DNA-monster, kunnen de twee methoden samen worden gebruikt, en ze kunnen elkaar aanvullen. Eerst wordt de PCR-methode gebruikt om DNA uit een klein monster te klonen en veel exemplaren te produceren.
Vervolgens worden de PCR-producten gebruikt met de plasmidevectormethode om het geproduceerde DNA te implanteren in bacteriële cellen die het gewenste eiwit zullen produceren.
Voorbeelden van DNA-klonen voor biotechnologie
Moleculaire biologie maakt gebruik van genklonering en DNA-replicatie voor medische en commerciële doeleinden. De bacteriën met gekloonde DNA-sequenties worden gebruikt om medicijnen te produceren en stoffen te vervangen die mensen met genetische aandoeningen niet zelf kunnen produceren.
Typische toepassingen zijn onder meer:
Biotechnologie maakt ook gebruik van genklonen in de landbouw om nieuwe kenmerken in planten en dieren te creëren of bestaande kenmerken te verbeteren. Naarmate meer genen worden gekloond, neemt het aantal mogelijke toepassingen exponentieel toe.
Voorbeelden van DNA-klonen voor onderzoek
DNA-moleculen vormen een kleine fractie van het materiaal in een levende cel en het is moeilijk om de invloeden van de vele genen te isoleren. De DNA-kloneringsmethoden leveren grote hoeveelheden van een specifieke DNA-sequentie om te bestuderen, en het DNA produceert eiwitten net zoals in de oorspronkelijke cel. DNA-klonen maakt het mogelijk om deze operatie voor verschillende geïsoleerde genen te bestuderen.
Typische onderzoeks- en DNA-technologie-toepassingen omvatten het onderzoeken van:
Wanneer meer DNA-sequenties worden gekloond, is het gemakkelijker om aanvullende sequenties te vinden en te klonen. De bestaande gekloonde DNA-segmenten kunnen worden gebruikt om te bepalen of een nieuw segment overeenkomt met het oude en welke delen verschillen. Het identificeren van een doel-DNA-sequentie is dan sneller en nauwkeuriger.
Voorbeelden van DNA-klonering voor gentherapie
In gentherapiewordt een gekloond gen gepresenteerd aan de cellen van een organisme waarvan het natuurlijke gen is beschadigd. Een vitaal gen dat een eiwit produceert dat nodig is voor een specifieke organisme-functie, kan worden gemuteerd, veranderd door straling of worden aangetast door virussen.
Wanneer het gen niet goed werkt, ontbreekt een belangrijke stof in de cel. Gentherapie probeert vervang het gen door een gekloonde versie die de vereiste stof zal produceren.
Gentherapie is nog steeds experimenteel en weinig patiënten zijn genezen met behulp van de techniek. De problemen liggen bij het identificeren van het enkele gen dat verantwoordelijk is voor een medische aandoening en het afleveren van veel exemplaren van het gen in de juiste cellen. Omdat het klonen van DNA meer voorkomt, is gentherapie in verschillende specifieke situaties toegepast.
Recente succesvolle toepassingen zijn onder meer:
Gentherapie is een van de meest veelbelovende toepassingen van DNA-klonering, maar andere nieuwe toepassingen zullen zich waarschijnlijk vermenigvuldigen naarmate meer DNA-sequenties worden bestudeerd en hun functie wordt bepaald. DNA-klonen levert de grondstof voor genetische manipulatie in de benodigde hoeveelheden.
Wanneer de rol van genen bekend is en hun juiste functie kan worden gewaarborgd door vervanging van defecte genen, kunnen veel chronische ziekten en zelfs kanker worden aangevallen en op genetisch niveau worden behandeld met behulp van DNA-technologie.
Gerelateerde inhoud: