Inhoud
- TL; DR (te lang; niet gelezen)
- Buffer en zout
- Detergentia oplossen
- Chelaatvormers en remmers
- Alkalische lysis
Lyse is een woord dat uit het Grieks komt en alleen betekent "splitsen" of "barsten". De termen hebben toepasselijk betrekking op wat er met cellen in een lysisbuffer gebeurt, een oplossing die ze openbreekt om hun inhoud te extraheren. Wetenschappers gebruiken lysisbuffers bij het extraheren van DNA of eiwitten uit cellen voor analyse, vooral in het geval van bacteriën. Het type cellysisbuffer varieert afhankelijk van het soort experiment, hoewel hier enkele veelvoorkomende keuzes zijn.
TL; DR (te lang; niet gelezen)
Lysisbuffers helpen cellen open te breken, zodat de inhoud ervan kan worden geopend of verwijderd. Sommige voorbeelden omvatten zouten, wasmiddelen, chelaatvormers en remmers en sommige alkalische chemicaliën.
Buffer en zout
Buffers stabiliseren de pH terwijl de cellen splitsen. Tris-HCL staat als een van de meest voorkomende chemicaliën voor buffering bij pH 8. HEPES is een andere veel voorkomende bufferchemicalie in deze experimenten. Natriumchloridezout kan ook de ionsterkte verhogen, de totale concentratie opgeloste stoffen buiten de cellen. Dit laatste punt is van enig belang, omdat water door celmembranen kan diffunderen van gebieden met een lage opgeloste stofconcentratie naar gebieden met een hoge opgeloste stofconcentratie.
Detergentia oplossen
Detergentia lossen celmembranen op zodat de inhoud van de cellen kan ontsnappen. Het hebben en amfipatische moleculaire structuur (d.w.z. moleculen met één uiteinde dat gemakkelijk in wisselwerking staat met watermoleculen terwijl het andere hydrofobe of "water-vrezende" uiteinde dat niet doet). Ze kunnen vetten oplossen door micellen te vormen, kleine clusters waar de hydrofobe staarten van de wasmiddelmoleculen naar binnen wijzen naar de vetmoleculen. Gebruikelijke wasmiddelen omvatten natriumdodecylsulfaat of SDS, NP-40 en tritonX.
Chelaatvormers en remmers
Lysisbuffers omvatten typisch ook cheleringsmiddelen zoals ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) of ethyleenglycol-tetra-azijnzuur (EGTA). Deze chemicaliën binden zich aan metaalionen met twee positieve ladingen (bijvoorbeeld magnesium en calcium), waardoor ze niet beschikbaar zijn voor andere reacties. Veel DNA-enzymen (eiwitten die DNA op kauwen) en proteasen (eiwitten die andere eiwitten opsplitsen) hebben magnesiumionen nodig om te functioneren, dus door hen dit belangrijke ingrediënt te ontnemen, helpen EDTA en EGTA het niveau van protease of DNAse-activiteit te verminderen. Ze sluiten het echter niet volledig uit, en sommige proteasen zijn niet afhankelijk van magnesiumco-factoren, dus lysisbuffers bevatten soms ook chemicaliën die proteaseremmers worden genoemd, die zich binden aan proteasen en voorkomen dat ze goed functioneren.
Alkalische lysis
Alkalische lysis, een veel voorkomende techniek voor het zuiveren van plasmiden uit bacteriën, omvat drie oplossingen. De eerste bevat glucose, tris-HCL-buffer, EDTA en RNAses. De glucose zorgt voor een hoge concentratie opgeloste stoffen buiten de bacteriën, zodat ze een beetje slap worden, waardoor ze gemakkelijker kunnen worden gelyseerd. De EDTA en tris-HCL werken zoals reeds beschreven, terwijl de RNAse alle RNA in de cel op kauwt om het uit de weg te ruimen. De tweede oplossing lyseert eigenlijk de cellen. Deze bevat SDS-wasmiddel en NaOH, wat de pH tot 12 of hoger verhoogt, waardoor eiwitten in de cel worden gedenatureerd en DNA in afzonderlijke strengen wordt gescheiden. De derde oplossing bevat kaliumacetaat om de pH terug te brengen naar een meer neutraal niveau zodat de plasmide-DNA-strengen weer bij elkaar kunnen komen. Ondertussen klonteren de gedenatureerde eiwitten op en slaan neer, terwijl de dodecylsulfaat-ionen samenkomen met de kaliumionen om een onoplosbare verbinding te vormen, die ook uit de oplossing precipiteert.