Inhoud
Het genetische blauw van een cel wordt gecodeerd in zijn genetisch materiaal of DNA. Omdat het DNA nooit de kern van de cel verlaat, is het noodzakelijk om eerst het DNA in messenger RNA (mRNA of poly (A) RNA) te transcriberen om deze informatie in het cytoplasma te krijgen waar andere eiwitten en biochemische componenten zich bevinden. Dit mRNA wordt vervolgens omgezet in eiwitten die vele functies van de cel uitvoeren. Om zeer zeldzame mRNA's te detecteren of te kwantificeren, probes voor microarrays te maken of bibliotheken van complementaire DNA-moleculen te construeren, moet mRNA worden geïsoleerd. Totale RNA (d.w.z. alle RNA in een cel) extractie en daaropvolgende mRNA-isolatie zijn echter geen elkaar uitsluitende processen; de eerste moet worden uitgevoerd om mRNA te kunnen extraheren.
Isolatie van mRNA uit totaal RNA
TRIzol-homogenisatie: Totaal RNA omvat alle mRNA, overdracht-RNA, ribosomaal RNA en andere niet-coderende RNA's. Om deze van andere cellulaire componenten te scheiden, wordt de cel eerst opengebroken om zijn inhoud vrij te geven. Dit wordt gedaan door cellen in pellets opnieuw te suspenderen door centrifugeren (spinnen met hoge snelheden) in TRIzol Reagent (Life Technologies). Andere versies van TRIzol (zoals Ambion's TRI Reagent) werken op dezelfde manier.
Totale RNA-isolatie: een reeks centrifugaties wordt gebruikt om de verschillende componenten (eiwitten, DNA, RNA) van de cel in lagen of fasen in de suspensie te scheiden. De bovenste, geel gekleurde fase bestaat uit vet en kan worden weggegooid. De gewenste fase is rood getint, bevat het totale RNA en blijft behouden. Na het uitvoeren van een fenol-chloroformextractie en een reeks alcoholwassingen met behulp van isopropanol en ethanol, kan het RNA worden gepelleteerd voor mRNA-isolatie. Voeg RNase-remmers toe om te voorkomen dat dit enzym het totale RNA afbreekt.
mRNA-extractie: het is gebruikelijk om een kit te gebruiken om mRNA's te isoleren, omdat zelfgemaakte lab-protocollen geen grote hoeveelheden zeer zuivere mRNA's genereren. Commerciële kits omvatten Invitrogen's FastTrack 2.0 of Ambion's Poly (A) Pure mRNA-isolatiekit. Deze basisstappen zijn gemeenschappelijk voor dergelijke kits:
a) Meng de RNase-geremde lysisbuffer uit de set met maximaal 300 microliter totaal RNA.
b) Verhit gedurende 5 minuten op 65 graden Celsius en koel vervolgens het monster onmiddellijk gedurende een minuut op ijs.
c) Meng dit met 0,5 M natriumchloride en los vervolgens Oligo dT (oligodeoxythymidylzuur) volledig op in dit monster.
d) Centrifugeer dit monster en win het supernatant, dat verschillende keren wordt gewassen in een reeks bindende en zoutarme buffers in de kits.
e) Eluteer mRNA enkele keren totdat een kit-gespecificeerd volume (bijvoorbeeld 500 microliter) wordt verkregen.
f) Neeg het eluaat neer met natriumacetaat en ethanolprecipitatie. Suspendeer opnieuw in tot 20 microliter met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water.
g) Bewaren bij -80 graden Celsius en controleren op kwaliteit en kwantiteit door spectrofotometrie.