Inhoud
Bij chemische reacties gekatalyseerd door een enzym, verlaagt het enzym de benodigde hoeveelheid activeringsenergie door tijdelijk te binden met het substraat en het in een gespannen toestand te draaien. De k (katalysator) of "kcat" voor de reactie verwijst naar de concentratie-onafhankelijke constante voor de snelheid waarmee een bepaald enzym een substraat tot een productmolecuul kan metaboliseren. Om kcat te berekenen, mengen wetenschappers eerst verschillende reageerbuizen met variërende concentraties substraat (bekend als een "enzymatische test") en testen ze met constante tijdsintervallen met een lichtspectrofotometer om de groeiende concentraties van productmoleculen te meten. Deze gegevens worden vervolgens in een grafiek uitgezet en geanalyseerd.
Aanvankelijke snelheden berekenen
Maak een grafiek van productconcentratie versus tijd voor de gegevens uit de eerste reageerbuis van de enzymatische assays. Opmerking: de horizontale as moet "tijd" zijn en de verticale as moet "productconcentratie" zijn.
Bereken de lineaire regressielijn voor de gegevenspunten die u hebt uitgezet in sectie 1, stap 1. Hoewel Excel en grafische rekenmachines dit lineaire model gemakkelijk kunnen bepalen, kunt u een schatting van de helling van de regressielijnen afleiden door het verschil in productconcentratie tussen aangrenzende gegevens te delen punten door hun verschil in tijd.
Noteer de helling van de lineaire regressielijn uit sectie 1, stap 2 als "initiële reactiesnelheid (Vo)". Opmerking: in het regressielijnmodel "= m + b" is de coëfficiënt "m" de helling.
Herhaal stap 1, 2 en 3 voor de rest van de reageerbuizen in de assay.
Vmax berekenen
Plot de inverse van substraatconcentratie voor elke reageerbuis versus de inverse van zijn initiële reactiesnelheid (uit sectie 1, stap 4). Als bijvoorbeeld de beginsnelheid voor een reageerbuis met een initiële substraatconcentratie van 50 micromolair (uM) 80 uM / s was, zouden de inversies 1/50 uM zijn voor de substraatconcentratie en 1/80 uM / s voor de initiële snelheid. Opmerking: de inverse substraatconcentratie moet op de horizontale as liggen en de inverse beginsnelheid op de verticale as.
Opmerking: substraatconcentratie moet op de horizontale as zijn en initiële reactiesnelheid moet op de verticale as zijn.
Bepaal de lineaire regressielijn voor de grafiek die u in sectie 2, stap 1 hebt uitgezet. Opmerking: omdat u het y-snijpunt voor de regressielijn moet kennen, moet u de punten van sectie 2, stap 1 in Excel of een grafische rekenmachine en gebruik de ingebouwde regressiemodelleringsfunctionaliteit.
Deel 1 door het y-snijpunt van de lineaire regressielijn. Dit geeft je de waarde van de inverse van Vmax, de maximale reactiesnelheid voor het enzym. Opmerking: als het lineaire regressiemodel de vorm "= m + b" heeft, dan is de waarde van "b" de y-intersect. Deel 1 door "b" om de inverse van Vmax te berekenen.
Deel 1 door het resultaat van sectie 2, stap 3 om de werkelijke waarde van Vmax te berekenen.
Bepaal de concentratie van het enzym in de oorspronkelijke test (zie de ruwe gegevens). Opmerking: de enzymconcentratie is hetzelfde voor alle reageerbuizen; alleen de substraatconcentraties variëren in de test.
Deel de Vmax (uit sectie 2, stap 4) door de enzymconcentratie (uit sectie 2, stap 5). Het resultaat is de waarde van Kcat.