Inhoud
Bij het werken met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is een goede kalibratie absoluut essentieel om betrouwbare kwaliteitsresultaten te garanderen. De juiste kalibratie van een HPLC-instrument begint met het maken van een geschikte kalibratiestandaard. In de meeste gevallen vereist kalibratie in feite een reeks normen van toenemende concentratie om een zogenaamde kalibratiecurve te produceren. Dit is een geplotte lijn en bijbehorende vergelijking die de relatie beschrijft tussen de concentratie van de te testen chemische stof en de reactie van de HPLC-detector.
Bepaal de chemische stof die u wilt testen voor het gebruik van de HPLC (de "analyt"). U kunt bijvoorbeeld een reeks frisdranken testen op fructosegehalte, in welk geval fructose de analyt is.
Verkrijgen van een hoeveelheid van de analytchemicaliën van geschikte zuiverheid. Normaal moet de zuiverheid hoger zijn dan 99% en moet de analyt worden gekocht bij een gerenommeerd chemisch leveringsbedrijf. In het geval van fructose koopt u bijvoorbeeld pure fructose van een chemische verkoper en niet van een supermarkt.
Bepaal de maximale en minimale verwachte concentraties van de analyt in de monsters die u op de HPLC wilt testen. In het geval van frisdranken onderzoekt u de etiketten van de dranken en bepaalt u het laagste en hoogste fructosegehalte van de dranken die u gaat testen. Houd er rekening mee dat het eerste monster (de frisdrank) kan worden verdund of anderszins kan worden gemanipuleerd tijdens de voorbereiding voor analyse (afhankelijk van de gebruikte HPLC-methode) en dat de analytconcentratie in de monsters die daadwerkelijk op de HPLC zijn geïnjecteerd, kan worden gewijzigd. Het is de analytconcentratie in de monsters zoals uitgevoerd op de HPLC die in overweging moet worden genomen.
Bepaal het oplosmiddel waarin u uw analyt oplost om kalibratiestandaarden te maken. Dit oplosmiddel moet de analyt goed kunnen oplossen in een relatief breed concentratiebereik (minstens zo hoog als in de monsters die u wilt testen). Ook zou dit oplosmiddel idealiter vrij gelijkaardig moeten zijn aan de "mobiele fase": het oplosmiddel dat wordt gebruikt om monsters door het HPLC-instrument te voeren.
Bereken de hoeveelheid analyt die nodig is om een "voorraadstandaard" -oplossing van de analyt te maken. Dit wordt gevonden door de vereiste concentratie van de standaard te vermenigvuldigen met het gewenste volume. De concentratie van het analyt in deze oplossing moet ten minste 10% hoger zijn dan de hoogst verwachte monsterconcentratie. Als de hoogst verwachte fructoseconcentratie in een frisdrankmonster 8 gram / 100 milliliter is, kan de voorraadstandaard worden gemaakt tot een concentratie van 10 gram fructose / 100 milliliter. Een redelijk volume is 500 milliliter, dus 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fructose zou nodig zijn.
Weeg de vereiste hoeveelheid analyt af tot een geschikt precisieniveau. Vaak is een gewichtswaarde in gram nauwkeurig tot op één of twee decimalen, maar voor sommige methoden kan meer precisie nodig zijn.
Breng de gewogen analyt over in een maatkolf van het benodigde volume en voeg het gewenste oplosmiddel toe aan de vulteken op de kolf. Het gebruik van een maatkolf (bijvoorbeeld in plaats van een maatbeker) verhoogt de nauwkeurigheid van de standaardconcentratiewaarde. Zorg ervoor dat alle analyt naar de kolf wordt overgebracht; gebruik indien nodig wat oplosmiddel.
Sluit de maatkolf en schud of keer voorzichtig om totdat de analyt volledig is opgelost.
Maak een reeks variërende verdunningen van de voorraadstandaard door bekende volumes van de voorraadstandaard in volumetrische kolven over te brengen, gebruik pipetten voor nauwkeurige overdracht en voeg vervolgens oplosmiddel toe. De laagste standaardconcentratie moet lager zijn dan het laagste te analyseren monster dat moet worden geanalyseerd. In het voorbeeld van frisdrank, als de laagste verwachte fructoseconcentratie in een monster 2 gram / 100 ml is, kan een standaard van 1 gram / 100 ml worden gemaakt. Dit zou gebeuren door een tienvoudige verdunning van de aandelenstandaard. De standaardreeks zou in totaal 5 of 6 concentraties moeten bevatten, dus extra verdunningen om normen van misschien 3, 5 en 8 gram fructose / ml te produceren zouden nodig zijn. U hebt nu een reeks standaardoplossingen waarmee u de HPLC kunt kalibreren.