Inhoud
High-performance vloeistofchromatografie (HPLC) is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om verbindingen te scheiden en te identificeren. Het is een type kolomchromatografie dat afhankelijk is van verschillende polariteiten van verbindingen in een oplossing om ze te scheiden. HPLC verschilt van standaard kolomchromatografie omdat het druk gebruikt om de oplossing sneller door de kolom te dwingen en daarom snellere en soms nauwkeurigere resultaten oplevert. Het doel is om verbindingen in de kolom te scheiden en ze afzonderlijk te laten verlaten.
co-elutie
Vanwege de snelheid van HPLC en de afhankelijkheid van verschillende polariteiten van verbindingen, kunnen twee verbindingen met vergelijkbare structuur en polariteiten tegelijkertijd of bijna gelijktijdig uit de chromatografie-apparatuur komen. Dit staat bekend als coelutie. Coëlutie maakt het moeilijk om precies te bepalen welk deel van het mengsel elueert.
Geadsorbeerde verbindingen
HPLC gebruikt meestal een glazen kolom gevuld met kralen gemaakt van verschillende materialen. De mengsels die door de kolom worden geperst, hebben chemicaliën die met verschillende sterkten aan de korrels binden. De sterkte van de binding, die afhangt van de gelijkenis in polariteit, bepaalt hoe lang de chemische stof aan de parel zal binden voordat deze wordt vrijgegeven. Sommige verbindingen binden zo sterk dat ze in wezen nooit worden vrijgegeven uit de korrels in de kolom en worden nooit gemeten in de oplossing die de kolom verlaat.
Kosten
Typische laboratoriumscheidingstechnieken omvatten het ontwikkelen van een test of scheidingsmethode en het vervolgens implementeren van die test om afzonderlijke verbindingen van een oplossing te scheiden. Meestal resulteert dit echter in meerdere oplossingen die ook procedures moeten ondergaan, wat leidt tot een exponentiële toename van complexiteit. Hoewel HPLC dit proces vaak kan vereenvoudigen en versnellen, kunnen de kosten voor het ontwikkelen van een HPLC-apparaat enorm worden. Het ontwikkelen van een HPLC-apparaat is, hoewel veel efficiënter, veel duurder dan het ontwikkelen van andere testen voor het scheiden van verbindingen. Dit maakt het financieel niet levensvatbaar voor veel kleine particuliere laboratoria.
ingewikkeldheid
HPLC wordt niet alleen gebruikt om eenvoudige verbindingen te scheiden, het wordt ook gebruikt om specifieke eiwitten uit een cellulair mengsel te isoleren. In dit geval zijn de kralen in de kolom meestal bedekt met een antilichaam dat specifiek is voor het eiwit dat u moet verzamelen. De eiwitten binden de antilichamen en de resterende oplossing wordt door de kolom geleid, vervolgens worden de eiwitten vrijgegeven met behulp van een andere oplossing en verzameld. Dit vereist een zeer bekwame technicus om de kolom te allen tijde te controleren en ervoor te zorgen dat het proces precies verloopt zoals gepland.