Inhoud
- Genomics en DNA-sequencing
- Definitie van DNA-sequencing
- DNA-sequencing: vroeg onderzoek
- De grootste ambitie van Sanger was het sequencen van grootschalige, hele genomen, maar sequencen van de basenparen van een minuscule bacteriofaag in vergelijking met de sequentie van de 3 miljard basenparen van het menselijk genoom. Desalniettemin was het leren hoe het hele genoom van een lage bacteriofaag te sequencen een belangrijke stap in de richting van het samenvoegen van het hele genoom van de mens. Omdat DNA en chromosomen uit miljoenen basenparen bestaan, scheiden de meeste sequentiemethoden DNA in kleine strengen, en vervolgens worden de DNA-segmenten aan elkaar gekoppeld; het kost gewoon tijd of snelle, geavanceerde machines.
- Basisprincipes van DNA-sequenties
- Methoden van DNA-sequencing: Sanger-methoden
- Een andere spannende ontwikkeling was de shotgun-methode die willekeurig tot 700 basenparen tegelijk bemonsterde en reeksen. Sanger staat ook bekend om zijn gebruik van de dideoxy-methode (dideoxynucleotide) die tijdens de DNA-synthese een ketenbeëindigend nucleotide invoegt om delen van DNA te markeren voor analyse. Dideoxynucleotiden verstoren de DNA-polymeraseactiviteit en voorkomen dat nucleotiden zich voortbouwen op een reeks DNA.
- DNA-sequentiestappen
- Vooruitgang in DNA-sequentietechnologie
- Het Human Genome Project
- Andere voorbeelden van DNA-sequenties
- Ethische implicaties van DNA-sequencing
Nucleotiden zijn de chemische bouwstenen van het leven en worden gevonden in het DNA van levende organismen. Elk nucleotide bestaat uit een suiker, fosfaat en een stikstof bevattende base: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G). De specifieke volgorde van deze nucleotidebasen bepaalt welke eiwitten, enzymen en moleculen door de cel worden gesynthetiseerd.
Het bepalen van de volgorde of de volgorde van nucleotiden is belangrijk voor de studie van mutaties, evolutie, ziekteprogressie, genetische testen, forensisch onderzoek en medicijnen.
Genomics en DNA-sequencing
genomics is de studie van DNA, genen, geninteracties en omgevingsinvloeden op genen. Het geheim van het ontrafelen van de complexe innerlijke werking van genen is het kunnen identificeren van hun structuur en locatie op chromosomen.
Het blauw van levende organismen wordt bepaald door de volgorde (of volgorde) van nucleïnezuur-baseparen in DNA. Wanneer DNA repliceert, paren adenine met thymine en cytosine met guanine; niet-overeenkomende paren worden beschouwd mutaties.
Sinds het dubbele helix deoxyribonucleic acid (DNA) -molecuul in 1953 werd geconceptualiseerd, zijn er dramatische verbeteringen aangebracht op het gebied van genomics en grootschalige DNA-sequencing. Wetenschappers werken er hard aan om deze nieuwe kennis toe te passen op geïndividualiseerde behandeling van ziekten.
Tegelijkertijd stellen lopende discussies onderzoekers in staat om de ethische implicaties van dergelijke snel exploderende technologieën voor te blijven.
Definitie van DNA-sequencing
DNA-sequentiebepaling is het proces van het ontdekken van de sequentie van verschillende nucleotidebasen in fragmenten van DNA. Whole-gen sequencing maakt vergelijkingen mogelijk van chromosomen en genomen aanwezig in dezelfde en verschillende soorten.
Het in kaart brengen van chromosomen is nuttig voor wetenschappelijk onderzoek. Analyse van de mechanismen en structuur van genen, allelen en chromosomale mutaties in DNA-moleculen suggereert nieuwe manieren om bijvoorbeeld genetische aandoeningen te behandelen en de groei van kankertumoren te stoppen.
DNA-sequencing: vroeg onderzoek
Frederick Sanger's DNA-sequentiemethoden vanaf het begin van de jaren zeventig sterk vooruitgegaan op het gebied van genomics. Sanger voelde zich klaar om DNA-sequencing aan te pakken na succesvol sequencing van RNA bij het bestuderen van insuline. Sanger was niet de eerste wetenschapper die zich bezighield met DNA-sequencing. Zijn slimme DNA-sequentiemethoden - ontwikkeld in samenwerking met collega's Berg en Gilbert - verdienden in 1980 een Nobelprijs.
De grootste ambitie van Sanger was het sequencen van grootschalige, hele genomen, maar sequencen van de basenparen van een minuscule bacteriofaag in vergelijking met de sequentie van de 3 miljard basenparen van het menselijk genoom. Desalniettemin was het leren hoe het hele genoom van een lage bacteriofaag te sequencen een belangrijke stap in de richting van het samenvoegen van het hele genoom van de mens. Omdat DNA en chromosomen uit miljoenen basenparen bestaan, scheiden de meeste sequentiemethoden DNA in kleine strengen, en vervolgens worden de DNA-segmenten aan elkaar gekoppeld; het kost gewoon tijd of snelle, geavanceerde machines.
Basisprincipes van DNA-sequenties
Sanger kende de potentiële waarde van zijn werk en werkte vaak samen met andere wetenschappers die zijn interesses deelden in DNA, moleculaire biologie en life science.
Hoewel langzaam en duur in vergelijking met de huidige sequencingtechnologieën, werden de DNA-sequentiemethoden van Sanger destijds geprezen. Na vallen en opstaan vond Sanger het geheime biochemische "recept" voor het scheiden van DNA-strengen, het creëren van meer DNA en het identificeren van de volgorde van nucleotiden in een genoom.
Hoogwaardige materialen kunnen gemakkelijk worden gekocht voor gebruik in laboratoriumstudies:
Methoden van DNA-sequencing: Sanger-methoden
Sanger kwam erachter hoe je DNA in kleine segmenten kunt knippen met behulp van het enzym DNA-polymerase.
Hij maakte vervolgens meer DNA van een sjabloon en voegde radioactieve tracers in het nieuwe DNA in om secties van de gescheiden strengen af te bakenen. Hij herkende ook dat het enzym een primer nodig had die kon binden aan een specifieke plek op de matrijsstreng. In 1981 schreef Sanger opnieuw geschiedenis door het genoom van de 16.000 basenparen van mitochondriaal DNA te berekenen.
Een andere spannende ontwikkeling was de shotgun-methode die willekeurig tot 700 basenparen tegelijk bemonsterde en reeksen. Sanger staat ook bekend om zijn gebruik van de dideoxy-methode (dideoxynucleotide) die tijdens de DNA-synthese een ketenbeëindigend nucleotide invoegt om delen van DNA te markeren voor analyse. Dideoxynucleotiden verstoren de DNA-polymeraseactiviteit en voorkomen dat nucleotiden zich voortbouwen op een reeks DNA.
DNA-sequentiestappen
De temperatuur moet tijdens het hele sequencingproces zorgvuldig worden aangepast. Eerst worden chemicaliën aan een buis toegevoegd en verwarmd om het dubbelstrengige DNA-molecuul te ontrafelen (denatureren). Vervolgens wordt de temperatuur afgekoeld, waardoor de primer kan binden.
Vervolgens wordt de temperatuur verhoogd om optimale activiteit van DNA-polymerase (enzym) aan te moedigen.
Polymerase gebruikt typisch de beschikbare normale nucleotiden, die in een hogere concentratie worden toegevoegd.Wanneer polymerase bij een "ketenbeëindigende" kleurstofgekoppelde nucleotide komt, stopt de polymerase en eindigt de keten daar, wat verklaart waarom de gekleurde nucleotiden "kettingbeëindigende" of "terminators" worden genoemd.
Het proces gaat vele, vele malen door. Uiteindelijk is het kleurstofgebonden nucleotide op elke afzonderlijke positie van de DNA-sequentie geplaatst. Gelelektroforese en computerprogramma's kunnen vervolgens de kleurstofkleuren op elk van de DNA-strengen identificeren en de volledige volgorde van DNA berekenen op basis van de kleurstof, de positie van de kleurstof en de lengte van de strengen.
Vooruitgang in DNA-sequentietechnologie
Reeksen met hoge doorvoer - algemeen aangeduid als sequencing van de volgende generatie - maakt gebruik van nieuwe ontwikkelingen en technologieën om nucleotidebases sneller en goedkoper dan ooit tevoren te sequencen. Een DNA-sequencing-machine kan gemakkelijk grootschalige stukken DNA aan. De hele genomen kunnen in enkele uren worden gedaan, in plaats van jaren met de sequentietechnieken van Sanger.
Volgende-generatie sequentiemethoden kunnen groot-volume DNA-analyse verwerken zonder de toegevoegde stap van amplificatie of klonen om voldoende DNA voor sequencing te krijgen. DNA-sequentiemachines voeren meerdere sequentiereacties tegelijkertijd uit, wat goedkoper en sneller is.
In wezen voert de nieuwe DNA-sequentietechnologie honderden Sanger-reacties uit op een kleine, gemakkelijk leesbare microchip die vervolgens wordt uitgevoerd door een computerprogramma dat de volgorde samenstelt.
De techniek leest kortere DNA-fragmenten, maar is nog steeds sneller en efficiënter dan de sequentiemethoden van Sanger, zodat zelfs grootschalige projecten snel kunnen worden voltooid.
Het Human Genome Project
De Menselijk genoom project, voltooid in 2003, is een van de meest bekende sequencing-studies die tot nu toe zijn gedaan. Volgens een artikel uit 2018 in Wetenschappelijk nieuws, het menselijke genoom bestaat uit ongeveer 46.831 genen, wat een formidabele uitdaging was om te sequencen. Topwetenschappers van over de hele wereld hebben bijna 10 jaar aan samenwerking en advies gewerkt. Geleid door het National Human Genome Research
Instituut, heeft het project met succes het menselijk genoom in kaart gebracht met behulp van een samengesteld monster van anonieme bloeddonoren.
Het Human Genome Project vertrouwde op bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC-gebaseerde) sequentiemethoden om baseparen in kaart te brengen. De techniek gebruikte bacteriën om DNA-fragmenten te klonen, wat resulteerde in grote hoeveelheden DNA voor sequencing. De klonen werden vervolgens verkleind, in een sequentiemachine geplaatst en geassembleerd in stukken die menselijk DNA vertegenwoordigen.
Andere voorbeelden van DNA-sequenties
Nieuwe ontdekkingen in genomics veranderen de benaderingen van ziektepreventie, detectie en behandeling ingrijpend. De overheid heeft miljarden dollars toegezegd aan DNA-onderzoek. Wetshandhaving vertrouwt op DNA-analyse om gevallen op te lossen. DNA-testkits kunnen worden gekocht voor thuisgebruik om voorouders te onderzoeken en genvarianten te identificeren die gezondheidsrisico's kunnen inhouden:
Ethische implicaties van DNA-sequencing
Nieuwe technologieën komen vaak met de mogelijkheid van sociaal voordeel, evenals schade; voorbeelden hiervan zijn slecht functionerende kerncentrales en massavernietigingswapens. DNA-technologieën brengen ook risico's met zich mee.
Emotionele zorgen over DNA-sequencing en gen-editing tools zoals CRISPR omvatten angst dat de technologie het klonen van mensen zou kunnen vergemakkelijken, of zou kunnen leiden tot mutante transgene dieren gecreëerd door een malafide wetenschapper.
Vaker hebben ethische kwesties met betrekking tot DNA-sequencing te maken met geïnformeerde toestemming. Gemakkelijke toegang tot direct-to-consumer DNA-testen betekent dat consumenten mogelijk niet volledig begrijpen hoe hun genetische informatie zal worden gebruikt, opgeslagen en gedeeld. Leken zijn mogelijk niet emotioneel klaar om te leren over hun defecte genvarianten en gezondheidsrisico's.
Derden zoals werkgevers en verzekeringsmaatschappijen kunnen mogelijkerwijs personen discrimineren die defecte genen dragen die ernstige medische problemen kunnen veroorzaken.