Inhoud
- Electrophorresis heeft beperkte monsteranalyse
- Metingen van elektroforese zijn niet nauwkeurig
- Aanzienlijk startvoorbeeld is vereist
- Alleen bepaalde moleculen kunnen worden gevisualiseerd
- Elektroforese is lage doorvoer
Gelelektroforese is een techniek waarbij biologische moleculen van elkaar worden gescheiden en worden geïdentificeerd in biologisch onderzoek of medische diagnostiek. Sinds hun ontwikkeling in de jaren zeventig zijn deze technieken van onschatbare waarde bij het identificeren van genen (DNA) en genproducten (RNA en eiwitten) van wetenschappelijk belang. In de afgelopen jaren zijn nieuwere technieken naar voren gekomen die meer specificiteit en detail geven over wat er gebeurt in levende systemen. Hoewel deze technieken de elektroforese niet hebben vervangen en geavanceerde manipulaties de levensvatbaarheid van de techniek kunnen vergroten, is het belangrijk om te beseffen wat gelelektroforese wel en niet kan doen.
Electrophorresis heeft beperkte monsteranalyse
Elektroforese is specifiek voor het weefsel dat u hebt bemonsterd. Als u bijvoorbeeld een Southern-vlek (een soort elektroforese) uitvoert op een wangstaafje, kijkt u naar genen uit de epitheelcellen van uw wang en nergens anders in uw lichaam. Soms kan dit gunstig zijn, maar onderzoekers zijn vaak geïnteresseerd in meer algemene effecten.
Technieken zoals in situ hybridisatie (ISH) kunnen een stuk weefsel nemen en genexpressie analyseren op elk klein gebied van dat monster.Zo kunnen onderzoekers met ISH naar elk hersengebied in een monster kijken, terwijl elektroforese technieken slechts naar een paar gebieden tegelijk kunnen kijken.
Metingen van elektroforese zijn niet nauwkeurig
Gelelektroforese kan vergelijkbare eiwitten met verschillende gewichten effectief scheiden (dit is een techniek die Western-blotting wordt genoemd). Het kan ze nauwkeuriger scheiden door een techniek die bekend staat als 2D-elektroforese; dit komt veel voor bij proteomics.
Helaas zijn alle metingen van deze techniek op zijn best semi-kwantitatief. Om de precieze massa (gewicht) van eiwitten te verkrijgen, moet massaspectroscopie worden gebruikt nadat het eiwit is gezuiverd door elektroforese. Bovendien is het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van verschillende moleculen afhankelijk van de banddichtheid (duisternis) van verschillende vlekken op de gel. Deze methode heeft een zekere mate van fout en monsters worden meestal meerdere keren uitgevoerd om schone resultaten te krijgen.
Aanzienlijk startvoorbeeld is vereist
Elektroforese is een techniek voor het isoleren en visueel identificeren van verschillende biomoleculen. Dit wordt gedaan door een elektrische stroom door de gel te leiden om geladen moleculen met verschillende gewichten te scheiden. Als de molecule waarin je geïnteresseerd bent niet voldoende voorkomt, is de band vrijwel onzichtbaar en moeilijk te meten.
DNA en RNA kunnen enigszins worden versterkt voordat elektroforese wordt uitgevoerd, maar het is niet praktisch om dit met eiwitten te doen. Daarom is een groot weefselmonster nodig om deze tests uit te voeren. Dit kan het nut van de techniek beperken, vooral bij medische analyses. Het is vrijwel onmogelijk om elektroforese uit te voeren op monsters uit een enkele cel; flowcytometrie en immunohistochemie worden vaker gebruikt om cel-voor-cel-expressie van eiwitten te beoordelen. Een techniek die PCR wordt genoemd, is uitstekend in het nauwkeurig meten van kleine hoeveelheden RNA.
Alleen bepaalde moleculen kunnen worden gevisualiseerd
Elektroforese is uitstekend in het scheiden en identificeren van middelgrote tot grote biomoleculen. Veel van de moleculen waar onderzoekers naar willen kijken, zijn echter kleiner; kleine hormonen, neurotransmitters en ionen kunnen niet worden gemeten met elektroforese. Dit is om twee redenen: ze reageren niet goed met het elektroforesepreparaat (meestal een techniek die SDS-PAGINA wordt genoemd) en, zelfs als ze dat deden, zijn ze te klein om goed te scheiden en zouden ze de bodem van de gel uitlopen. Deze moleculen worden in plaats daarvan gemeten door technieken zoals RIAA's (radio-immunoassays) en ELISA's (enzym-gekoppelde immunosorbant assay).
Elektroforese is lage doorvoer
Gelelektroforese heeft over het algemeen een lage doorvoer, wat betekent dat het niet bijzonder snel gegevens produceert. Contrastelektroforese, waarbij u tegelijkertijd een klein handvol RNA-moleculen kunt bekijken, met PCR (polymerasekettingreactie), die tegelijkertijd duizenden monsters kan beoordelen. Evenzo kan flowcytometrie metingen verrichten uit duizenden individuele cellen en complexe correlaties maken, terwijl elektroforese massaal naar cellen kijkt en dergelijke fijne onderscheidingen niet kan maken. PCR en flowcytometrie vertegenwoordigen respectievelijk massaal parallelle en seriële processen, en beide overtreffen de mogelijkheden van elektroforese om onderzoeksgegevens te genereren veruit.