Inhoud
- Hoe gelelektroforese werkt
- Een eenvoudige elektroforese procedure
- Bepaling van de lengte van onbekende fragmenten
Als het gaat om het meten van de lengte van DNA-fragmenten, die veel kleiner zijn dan cellen, hebben microbiologen een truc nodig en de meest geschikte is gelelektroforese. Deze methode berust op het feit dat DNA-fragmenten worden geladen en het is een alternatief voor duurdere methoden, zoals röntgenkristallografie, die verantwoordelijk was voor de ontdekking van de dubbele helixstructuur van DNA.
Hoe gelelektroforese werkt
Omdat DNA-moleculen worden geladen, worden ze beïnvloed door een elektrische stroom. Wanneer u ze in een neutrale gel plaatst en een stroom over de gel plaatst, migreren de moleculen naar de positieve elektrode (anode). Omdat DNA-moleculen van verschillende grootte dezelfde lading dragen, reizen de kleinere sneller, dus dit proces scheidt de moleculen in banden die kunnen worden vergeleken met monsters van bekende grootte.
Een eenvoudige elektroforese procedure
De gel wordt meestal gemaakt van agarose, een polysacharide die bij verhitting in een bufferoplossing een halfvaste, licht poreuze gel vormt. Aan het ene uiteinde vormt de gel kleine inkepingen die putten worden genoemd, waarbij de onderzoeker de onderzochte DNA-monsters plaatst, samen met referentiemonsters van bekende lengte, een DNA-ladder genoemd. De lengtes van de ladderfragmenten zijn vooraf bepaald met een andere methode, zoals röntgenkristallografie.
Wanneer de gel wordt ondergedompeld in een geleidende oplossing en spanning wordt aangelegd, beginnen de fragmenten door de gel te migreren - de kleinere eerst en de grotere, langzamere achter. Ze vormen zichzelf uiteindelijk in spectrumachtige banden naar grootte.
Zodra dit gebeurt, schakelt de onderzoeker de stroom uit, infuseert de gel met een DVA-bindende kleurstof en onderzoekt de monsters onder ultraviolet licht. Met behulp van de ladder als referentie kan de onderzoeker de grootte van elk van de fragmenten in een zichtbare band bepalen. Alleen banden zijn zichtbaar - afzonderlijke DNA-fragmenten zijn te klein om te zien.
Bepaling van de lengte van onbekende fragmenten
De kans is niet groot dat elke band in een monster overeenkomt met een band op de ladder, dus om de grootte van deze onbekende fragmenten te bepalen, maken wetenschappers meestal een grafiek. Op de x-as is de afstand afgelegd door elke band in de ladder in millimeters, terwijl op de y-as de grootte van elke band is. Wanneer de punten met elkaar zijn verbonden door een curve, kan de grootte van elke band worden geëxtrapoleerd uit de curve na het meten van de afstand die door die band is afgelegd in millimeters.