Inhoud
Gewoonlijk bevat elk DNA-molecuul in uw cellen twee strengen die met elkaar zijn verbonden door interacties die waterstofbruggen worden genoemd. Verandering in omstandigheden kan echter het DNA "denatureren" en veroorzaken dat deze strengen uit elkaar gaan. Het toevoegen van sterke basen, zoals NaOH, verhoogt de pH dramatisch, waardoor de waterstofionconcentratie van de oplossing wordt verlaagd en dubbelstrengs DNA wordt gedenatureerd.
Effecten van pH
De hydroxide-ionconcentratie en pH hebben een directe correlatie, wat betekent dat hoe hoger de pH, hoe hoger de hydroxide-concentratie. Evenzo, hoe lager de waterstofionconcentratie daalt. Bij hoge pH is de oplossing dan ook rijk aan hydroxide-ionen, en deze negatief geladen ionen kunnen waterstofionen van moleculen aftrekken zoals de basenparen in DNA. Dit proces verstoort de waterstofbinding die de twee DNA-strengen bij elkaar houdt, waardoor ze uit elkaar gaan.
RNA versus DNA
In tegenstelling tot RNA mist DNA een hydroxylgroep op positie 2 in elke suikergroep. Dit verschil maakt DNA veel stabieler in alkalische oplossing. In RNA kan de hydroxylgroep op positie 2 een waterstofion afgeven aan de oplossing bij hoge pH, waardoor een zeer reactief alkoxide-ion ontstaat dat de fosfaatgroep aanvalt die twee aangrenzende nucleotiden bij elkaar houdt. DNA lijdt niet aan dit defect en geniet dus een opmerkelijke stabiliteit bij hoge pH.
Alkalische lysis
Moleculaire biologen maken vaak gebruik van alkalische denaturatie om plasmide-DNA uit bacteriën te isoleren. Plasmiden zijn kleine lussen van DNA gescheiden van het bacteriële chromosoom. In een alkalische lysis-miniprep voegen biologen wasmiddel en natriumhydroxide toe aan in suspensie gesuspendeerde bacteriën. Het reinigingsmiddel lost het bacteriële celmembraan op, terwijl natriumhydroxide de pH verhoogt en de oplossing zeer basisch maakt. Terwijl de gebroken cellen hun inhoud vrijgeven, scheidt het DNA binnenin zich in zijn samenstellende strengen of denatureert.
opnieuw hybridiseren
Zodra de bioloog het DNA uit de cel extraheert, voegt hij een ander reagens toe om de oplossing terug te brengen naar een meer neutrale pH en het wasmiddel neer te slaan. De verandering in pH maakt het mogelijk dat de plasmidestrengen opnieuw hybridiseren; het omvangrijke chromosoom kan echter niet hetzelfde doen, dus de bioloog kan het samen met het wasmiddel, gedenatureerde eiwitten en andere geassorteerde rommel verwijderen, waardoor het plasmide achterblijft. Alkalische lysis zuivert het plasmide-DNA niet volledig; het dient eerder als een "snelle en vuile" manier om het uit de cel te halen en de meeste andere verontreinigingen te verwijderen.