Inhoud
DNA
Deoxyribonucleïnezuur en eiwitten. DNA is georganiseerd in eenheden die genen worden genoemd, die elk coderen voor een bepaalde RNA- of eiwitsequentie. Genen worden bestudeerd om te leren over biologische structuur en functie, evolutie, ziekte en vele andere aspecten van levende systemen. Om genen in detail te bestuderen, moet DNA worden geïsoleerd en gezuiverd uit interessante cellen.
DNA-extractie
Hoewel DNA uit een enkele cel kan worden geëxtraheerd en bestudeerd, is het niet genoeg om met het blote oog te zien. Om een voldoende hoeveelheid voor spooling te krijgen, hoe meer cellen je hebt om mee te werken, hoe beter (vele miljoenen).
Exacte protocollen variëren aanzienlijk om rekening te houden met de unieke kenmerken van specifieke monsters, maar de algemene stappen zijn homogenisatie, lysis, digestie, scheiding en verzameling. De procedure kan het beste worden uitgevoerd in een kleine (afhankelijk van de grootte van het monster) glazen of plastic buisje.
Een monster wordt in het algemeen gemengd of gemalen om de cellen grondig van elkaar te scheiden. Dit maakt de celingrediënten toegankelijker voor de reagentia die volgen. Detergens of enzymen worden vervolgens aan het homogenaat toegevoegd om de celmembranen (en nucleaire membranen als de cellen eukaryotisch zijn) te lyseren om het DNA vrij te maken. Op dit punt is het DNA omgeven door eiwitten, lipiden, koolhydraten --- al het andere dat zich in de cellen bevond.
Een verdere enzymatische vertering kan nodig zijn om eiwitten af te breken, zodat ze niet binden aan DNA en de verzameling ervan verstoren. DNA wordt gescheiden van de rest van de celinhoud door koude, pure, ethyl- of isopropylalcohol toe te voegen. DNA is niet oplosbaar in deze alcoholen, dus het zal condenseren om te proberen het contact met de alcohol te minimaliseren. Het gecondenseerde DNA wordt vervolgens verzameld, gewoonlijk door centrifugeren of spoelen.
DNA-spooling
DNA-verzameling door spoolen is effectief wanneer een grote hoeveelheid DNA wordt verkregen door een extractieprocedure. Het is ook een uitstekende demonstratiemethode omdat een indrukwekkende wirwar van puur DNA duidelijk zichtbaar is.
Om DNA te spoelen moet de scheidingsstap voorzichtig worden uitgevoerd. Als het geen deel uitmaakte van het eerder toegevoegde lysisreagensmengsel, moet een geconcentreerde zoutoplossing (natriumchloride) aan de oplossing worden toegevoegd vóór de stap van het toevoegen van alcohol. De koude alcohol wordt langzaam langs de zijkant van de reageerbuis gegoten om een laag bovenop de waterige oplossing te vormen, waarbij mengen wordt vermeden. Indien correct gedaan, zal de alcohol zijn eigen laag bovenop de zoute laag vormen. Dan komt de wachtrij.
Om het DNA uit de zoute laag te verzamelen, plaatst u voorzichtig een glazen roerstaaf door de alcohollaag totdat deze de bodem van de buis raakt. Draai de staaf langzaam tussen de vingers, terwijl je naar de interface tussen de twee lagen kijkt. Als er voldoende DNA aanwezig is, zal het samenklonteren op het grensvlak tussen de lagen om een melkachtige doorschijnende massa te vormen. Draai de staaf om het DNA eromheen te wikkelen (dat is het spoelgedeelte) en trek het uit de buis. Het DNA kan worden overgebracht naar een andere tube pure alcohol voor opslag of verdere analyse.