Inhoud
Kwantificeer uw RNA-monster door de absorptie van ultraviolet licht (UV) te meten. Een nano-drop spectrofotometer gebruikt slechts één of twee microliter van uw monster, die u kunt herstellen. Andere spectrofotometers vereisen een veel groter monster. De extinctiecoëfficiënt voor nucleotiden bij een UV-golflengte van 260 nm in een lichtpad van 1 cm is 20. Op basis van deze extinctiecoëfficiënt is de absorptie van 40 µg / ml RNA onder dezelfde omstandigheden één. Met behulp van deze informatie kunt u de concentratie van uw RNA-monster berekenen.
Maak zo nodig een verdunning van uw monster. Een standaardverdunning voor een microcuvette is 1:40. Maak deze verdunning door 2 µL RNA-monster toe te voegen aan 78 µL steriel water.
Volg de protocollen van uw specifieke spectrofotometer om de machine te kalibreren met behulp van een blanco en bepaal vervolgens de optische dichtheid van uw monster bij een UV-golflengte van 260 nm.
Vermenigvuldig de absorptie van uw monster met uw verdunningsfactor met 40μg RNA / ml. De vergelijking zou zijn: "RNA-concentratie (µg / ml) = (OD260) x (verdunningsfactor) x (40 µg RNA / ml) / (1 OD260-eenheid)" (Hofstra.edu) Bijvoorbeeld: als u uw monster hebt verdund met 1:40 en je absorptiewaarde was 0,08, je zou 0,08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0,13 µg / μL vermenigvuldigen
Bepaal de zuiverheid van uw monster door nog een absorptiewaarde te doen bij een UV-golflengte van 280 nm. De verhouding OD 260 / OD 280 geeft aan of - en op welk niveau - uw monster is verontreinigd met eiwit of fenol. Een resultaat van 1,8 tot 2,0 duidt op kwaliteit RNA.