Inhoud
- Wat is gelelektroforese?
- Componenten van elektroforese
- De gel vormen
- Hoe werkt elektroforese?
- Lading en grootte Bepaal de DNA-banden
- Toepassingen en gebruik van elektroforese
Gelelektroforese, vaak ook DNA-elektroforese of eenvoudigweg elektroforese genoemd, is een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten (en andere geladen moleculen) naar grootte te scheiden. Dit wordt meestal gedaan met behulp van agarosegel en elektrische lading om fragmenten van elkaar te scheiden.
Deze techniek heeft een paar toepassingen, waaronder het onderzoeken van DNA, DNA-vingeren, criminologie en verschillende medische toepassingen.
Wat is gelelektroforese?
Gelelektroforese is een techniek waarmee wetenschappers geladen moleculen kunnen scheiden op basis van grootte. Dit omvat DNA, RNA en eiwitten.
Vergeet niet dat DNA en RNA een lichte negatieve lading hebben dankzij negatief geladen zuurstofmoleculen in de suiker-fosfaatruggengraat van het molecuul. Eiwitten kunnen een reeks ladingen hebben, afhankelijk van de aminozuren in de polypeptideketen.
Componenten van elektroforese
Om elektroforese uit te voeren, moet eerst de gel worden gemaakt. Dit kan in bijna elk laboratorium; agarosegels komen het meest voor. Om de gel te maken, wordt agarose poeder gemengd met een speciale buffer genaamd elektroforese buffer. Dit mengsel wordt vervolgens verwarmd tot de agarose is opgelost en volledig in de bufferoplossing is gemengd.
Merk op dat sommige elektroforese-protocollen de toevoeging van ethidiumbromide (Et-Br) vereisen. Dit kleurt alle DNA dat bij elektroforese wordt gebruikt, zodat u de positie van de fragmenten onder UV-licht kunt bekijken.
De gel vormen
Dit wordt vervolgens in een rechthoekige vorm gegoten, een gelschaal genoemd. Samen met de mal die de rechthoekige gel maakt die wordt gebruikt voor elektroforese, wordt een kam geplaatst aan een van de uiteinden van de gel. Deze kam maakt de putten waar de monsters die u via elektroforese wilt scheiden, worden geladen. Je kunt hier een foto zien.
Nadat de gel is uitgehard, wordt de putkam verwijderd en wordt de gel in een speciale elektroforesetank geplaatst. Een andere buffer wordt in de tank gevuld totdat een kleine laag buffer de agarosegel volledig bedekt.
Deze tank produceert een elektrische stroom (variërend van 50 tot 150 V) door de bufferoplossing en op zijn beurt door de agarosegel. De putjes van de agarosegel worden aan het negatieve einde van de stroom geplaatst (de kathode) met het andere uiteinde van de gel aan het positieve uiteinde van de stroom (de anode).
Hoe werkt elektroforese?
Voordat de elektrische stroom door de tank en gel loopt, worden uw monsters in de putten geladen. Dit gebeurt met behulp van een micropipet. Een "marker" -monster, ook bekend als een DNA-ladder, is een monster met bekende DNA-fragmentgroottes die u kunnen helpen uw monsters te vergelijken en de grootte te begrijpen van het monster dat u test.
Vaak een kleurstof volgen (ook wel een laadkleurstof genoemd) wordt aan elk monster toegevoegd om u te helpen het monster in de putjes te laden. De kleurstof helpt je ook om de beweging van de monsters door de gel te volgen.
Dus hoe bewegen de monsters eigenlijk door de gel en scheiden ze op maat? Het heeft te maken met de elektrische stroom die door de agarosegel loopt, samen met de grootte / structuur van de fragmenten en agarosegel.
Lading en grootte Bepaal de DNA-banden
Vergeet niet dat DNA-lading over het algemeen is negatief . Dus wanneer deze monsters in putten worden geplaatst die zich dicht bij het negatieve uiteinde van de elektrische stroom bevinden, zal dit ertoe leiden dat het negatief geladen DNA beweegt weg van de kathode (negatieve lading) en verplaatsen naar de anode (positieve lading) aan het andere uiteinde.
Naast deze beweging van de monsters, scheidt elektroforese ook de monsters en fragmenten in die monsters op grootte. Dit is zo omdat kleinere moleculen en fragmenten kunnen beweeg sneller en gemakkelijker door de gel terwijl grotere moleculen en fragmenten langzamer bewegen. Dit betekent dat kleine fragmenten sneller naar het einde van de gel gaan dan grotere en, als gevolg, scheidt elk fragment op grootte.
Nadat de gel ongeveer een uur is gebruikt (in de meeste protocollen), wordt de lading uitgeschakeld en wordt de gel geanalyseerd. U ziet een verschillende rechthoekige band, vaak de DNA-band of eiwitband genoemd, op verschillende punten langs de gel. Elke band vertegenwoordigt één fragment dat langs de gel is bewogen.
Toepassingen en gebruik van elektroforese
Er zijn veel toepassingen voor elektroforese in het lab. Hier zijn er een paar: